附注2：API 20E使用说明书
1.试子条的准备：将5ml蒸馏水或软化水注入培养盒底部的蜂窝小凹中，造成一个湿盒。
2.在盘的长边写上菌株号，，再将试条放入盒中。
3.取新鲜菌落1个悬浮于0.85%的生理盐水5ml中，按照要求用滴管滴加到试条中，CIT、VP、GEL试验滴满管部和杯部，其它试验仅滴满管部（注意滴加时小心，不能产生气泡）。
4.ADH、LDC、ODC、H2S、URE试验用矿物油覆盖，以造成厌气环境。
盖好盒盖，于37℃培养18-24小时。
5.试条判读：根据判读表判读所有反应（阳性或阴性），①如果有3个或3个以上试验为阳性，在报告单上记录结果后，观察还需要附加试剂的试验结果：TDA试验、IND试验、VP试验，然后判读结果。②如果阳性结果少于3个，继续培养24小时，再进行判定。
6.结果判定：每3个试验为1组，阳性按顺序赋予1、2、4的数值，根据试子条上20个反应可得到一个7位数的编码（氧化酶反应作为第21个反应），根据数据库（V4.1）得到鉴定结果。也可将试子条直接插入计算机鉴定系统，直接得到结果。
二、金黄色葡萄球菌的分离鉴定
1.范围
本方法规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定方法。
本方法适用于牛奶和发病动物组织中金黄色的分离和鉴定。
2.设备和材料
2.1 冰箱：0℃-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：37℃±1℃和42℃。
2.3 显微镜：10×--100×。
2.4 采样管。
2.5 灭菌试管。
2.6 平皿。
2.7 自动细菌鉴定仪。
2.8 API STAPH试子条。
2.9 恒温摇床
2.10 冻存管
3.培养基和试剂
3.1 Baird－Parker琼脂
3.2 营养肉汤
3.3 营养琼脂
3.4 新鲜兔血浆
3.5 0.3%过氧化氢液
4.金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序
金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序见图2
2000-3000 rpm，15 min弃上清 Baird－Parker琼脂灰色或黑小菌落，周围淡色、透明 营养琼脂增菌 API Staph拭条鉴定金葡菌牛奶血浆凝固酶试验凝固金葡菌触酶试验阳性 扁桃体、发病动物组织
5.操作步骤
5.1 采样
5.1.1 牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶2ml，置入灭菌小离心管中，0-4℃保存，不超过48小时。
5.1.2 动物组织样品：无菌操作取发病动物组织，0℃-4℃保存不超过48小时。
5.2 金黄色葡萄球菌的分离
5.2.1 分离培养
5.2.1.1 将采样得到的牛奶样品，以2000～3000 r/min离心15 min，弃上清，用灭菌接种环醮起沉淀划线接种于Baird－Parker平皿，36℃培养24小时。
5.2.1.2 无菌操作将发病动物组织直接划线，接种于Baird－Parker平皿，36℃培养24小时。
5.2.2 挑取圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈的可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一步细菌鉴定。
5.3 金黄色葡萄球菌的鉴定（以下方法可任选其一）
5.3.1 API staph试条鉴定
5.3.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验（附注3），应为阳性。
5.3.1.2 将待检细菌单个菌落，悬浮于5ml灭菌生理盐水，用API staph试子条按照使用说明书（附注4）操作，菌液和试剂滴加完毕后，37℃培养18-24小时，用细菌鉴定仪判读结果。
5.3.1.3 将鉴定出的金黄色葡萄球菌结冻保存，待进行药敏试验。
5.3.2 血浆凝固酶试验法
5.3.2.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验（附注3），应为阳性。
5.4.2.2 吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉汤培养物或生理盐水悬液0.5mL（1个麦氏单位），振荡摇匀，放36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
5.4.2.3 如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，判为阳性结果。
附注3：触酶试验
用接种环挑取新鲜待检菌的纯化菌落置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液1 滴，观察结果。滴加3%过氧化氢溶液后立即产生气泡的为阳性。
附注4：API staph试子条按照使用说明书
1.试子条的准备：将5ml蒸馏水或软化水注入培养盒底部的蜂窝小凹中，造成一个湿盒。
2.在盘的长边写上菌株号（不记在盖上，以免错放），再将试条放入盒中。
3.取在血琼脂或营养琼脂上培养18-24小时的新鲜纯化、经触酶试验阳性的菌落，悬浮于0.85%的生理盐水5ml中，使其浓度等于0.5麦氏单位，按照要求用滴管滴加到试条小管中，试验仅滴满管部（注意滴加时小心，不能产生气泡）。
4.ADH、URE用矿物油滴加到杯部，以造成厌气环境。盖好盒盖，于35℃--37℃培养18-24小时。
5.试条判读：加入试剂，观察反应： VP测定、NIT测定、PAL测定按照要求滴加试剂后进行判读阴性或阳性。
