注：直接填写检测的MIC数值。
附件5
动物源细菌分离和鉴定方法
一、大肠杆菌、沙门氏菌的分离和鉴定
1.范围
本方法规定了用于耐药性测定的动物源大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定方法。
本方法适用于各种动物及其组织中大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定。
2.设备和材料
2.1 冰箱：0℃-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：37℃±1℃和42℃。
2.3 显微镜：10×--100×。
2.4 采样管。
2.5 采样棉拭子、剪子。
2.6 灭菌试管。
2.7 平皿。
2.8 自动细菌鉴定仪。
2.9 API 20E试子条。
2.3 恒温摇床
2.4 冻存管
3.培养基和试剂
3.1 运送培养基
3.2 麦康凯琼脂
3.3 沙门氏菌显色琼脂或XLT4琼脂
3.4 营养肉汤
3.5 鉴定用大肠杆菌、沙门氏菌阳性血清
3.6 四硫磺酸盐增菌液（TTB）
4.大肠杆菌和沙门氏菌分离和鉴定程序
大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定程序见图1
动物泄殖腔拭子用接种环接种于麦康凯琼脂按1：10接种四硫磺酸盐增菌液（TTB）42℃24h 运送培养基或营养肉汤发病动物带菌组织（做成匀液）挑取大肠杆菌可疑菌落纯化氧化酶试验（阴性）沙门氏菌显色培养基或XLT4琼脂挑取沙门氏菌可疑菌落纯化 API 20E试条自动细菌鉴定仪大肠杆菌沙门氏菌检测invA基因确认三糖铁（TSI）和硫化物吲哚运动性培养基（SIM）鉴定沙门氏菌大肠杆菌
5.操作步骤
5.1 采样
到已选定的养殖场或屠宰场，用灭菌棉签采动物泄殖腔样品，置入1-2ml肉汤或运送培养基中0-4℃保存。采发病动物组织时，用无菌操作取少量动物组织至于灭菌试管内，0-4℃保存，不超过48小时。
5.2 大肠杆菌的分离
5.2.1 取泄殖腔拭子样品用接种棒直接接种于麦康凯琼脂平面，动物组织样品首先制成匀液，然后用接种棒接种于麦康凯琼脂平面，37℃培养18-24小时。
5.2.2 挑取粉红色、边缘光滑的大肠杆菌可疑菌落，用麦康凯培养基纯化一代，然后接种于营养琼脂平面37℃培养12-24小时，待进一步细菌鉴定。
5.3 沙门氏菌的分离
5.3.1 将泄殖腔拭子或制成匀液的动物组织样品与增菌培养基按1：10的比例，接种于TTB增菌液中，42℃培养24小时。
5.3.2 将增菌液摇匀，用接种环接种于沙门氏菌显色培养基37℃培养22-24小时或XLT4琼脂上42℃培养22-24小时。
5.3.3 将沙门氏菌显色培养基上紫色的沙门氏菌可疑菌落或XLT4琼脂培养基上中央黑色边沿透明的沙门氏菌可疑菌落接种于营养琼脂平面37℃培养16-24小时，待进一步细菌鉴定。
5.4 大肠杆菌和沙门氏菌的鉴定（以下方法可任选其一）
5.4.1 API 20E试验条鉴定
5.4.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行氧化酶试验（附注1），应为阴性。
5.4 .1.2 将待检细菌单个菌落，悬浮于5ml灭菌生理盐水，用API 20E试子条按照使用说明书（附注2）操作，菌液和试剂滴加完毕后，37℃培养18-24小时，用细菌鉴定仪判读结果。
5.4.1.3 将鉴定出的大肠杆菌和沙门氏菌结冻保存，待进行药敏试验。
5.4.2 其它方法
5.4.2.1 大肠杆菌的鉴定
5.4.2.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行氧化酶试验（附注1），应为阴性。
5.4.2.1.2 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌用穿刺法接种于三糖铁（TSI）琼脂中，37℃培养22-24小时，观察结果应表面黄色，H2S阴性，产气。
5.4.2.1.3 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌用穿刺法接种于硫化物吲哚运动性培养基（SIM），37℃培养22-24小时，观察结果应产气，H2S阴性，运动或不运动，吲哚阳性。
5.4.2.2 沙门氏菌的鉴定：设计invA基因的引物，上游为5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′，下游为5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C -3′，反应条件：95℃预变性5min，94ºC 30s， 64ºC 30s， 72ºC 30s for 30 cycles，得到扩增长度为284 bp的扩增产物为沙门氏菌阳性。
附注1：氧化酶试验
1.原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果与细胞色素C的存在有关。
2.方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂（10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液）1滴，1min内观察结果。也可将试剂滴加到菌落上进行试验。
3.结果判定：阳性者立即变粉红色，5～10s内呈深紫色。阴性为无色。
4.注意事项： ①试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。②10g/L盐酸四甲基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。
